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超分辨光学成像

作者:     发布时间:2018年10月24日     阅读次数:847

分辨光学成像特指分辨率打破了光学显微镜分辨率极限(200nm)的显微镜,技术原理主要有受激发射损耗显微镜技术和光激活定位显微镜技术。

管中亦可窥豹——受激发射损耗显微镜

     传统光学显微镜采用宽场成像的方式,照明光一次照亮整个成像范围,然后用相机对整个成像范围进行曝光成像,一次获得整幅图像。“管中窥豹”型的扫描成像则有所不同,照明光聚焦在样品上,形成一个极小的光点——也就是所谓的“管”,每次只对光点对应的区域进行成像;当我们改变光点的位置,使它依次扫遍整个样品,也就获得了一幅完整的图像。有人要问了,即使采用“管中窥豹”的方式,每次聚焦的光点依然受到衍射极限限制,系统分辨能力比起所谓的宽场成像没有提高,扫描过程又增加了系统的复杂度,不是自找麻烦吗?Stefan W. Hell的回答很简单:只要设法缩小“管中窥豹”的“管”,就能提高系统的分辨能力,实现超分辨。

     通常的荧光成像是这样的:荧光分子在吸收了照明光(或者叫激发光)A之后,会在很短的时间持续发出荧光B。扫描成像系统的分辨能力取决于A在样品处的聚焦光点大小。Hell找到了荧光的开关——第三种光C,在C的照射下,荧光分子即使吸收了激发光A,也没法再发出荧光BHell让开关C同样打在样品上,形成一个四周亮、中心暗的“面包圈”,“面包圈”中心的暗区域比艾里斑还要小;然后把面包圈套在艾里斑上,就像在“管”的出口又加了一个小孔,使“管”的直径大大减少,也就提高了整台显微镜的分辨能力。

 

“面包圈”限制了激发光A的有效范围

“我只看到星星”,“我看到了银河”——光激活定位显微

  荧光分子是荧光样品的最小发光单元,由于衍射极限的限制,在相邻的两个荧光分子同时点亮时,我们只能看到一个光斑,但如果每次只点亮一个分子,就可以通过光斑,计算得到荧光分子的准确位置。

Eric BetzigWilliam E. Moerner采用的就是这样一种方法,如果说STED技术核心是“擦除”,那么PALM技术的核心就是“定位”:Moerner发现存在光D可以“打开”荧光。通过控制D的照射剂量,保证每次只有少量荧光分子处在打开状态;当荧光分子在开与关之间切换时,整幅图像中的荧光信号就会像银河中的星星一样亮暗闪烁,只要进行足够多次的开关和成像,就可以组合出整个样品的图像。


溶酶体膜在不同显微镜下的成像结果。(左)传统光学显微镜成像;(中)光激活定位显微镜成像;(右)放大的光激活定位显微镜成像。


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